طراحی و ساخت کاست ژنی ctxb-gfp-stxbو بررسی بیان آن در e. coli سویه (bl۲۱ (de۳

زمینه و هدف : پروتئین­های نوترکیب کایمریک ، به منظور افزایش بیان پروتئین ­ های محلول، تسهیل در تخلیص آن­ها و تولید پلی­پپتید چند­منظوره، ابداع شده­اند. هدف از این تحقیق، ساخت کاست ژنی ctxb -gfp-stxb و بررسی بیان آن به منظور بررسی میزان جذب و دفع آنتی­ژن الحاقی در مطالعات بعدی می باشد.   مواد و روش ها : پس از تهیه پرایمر­های مورد نیاز برای ژن­های gfp به عنوان ژن گزارشگر، ctxb و stxb ، از تکنیک pcr برای تکثیر ژن­ها استفاده شد. ژن­های تکثیر شده، در وکتور pgem ، همسانه­سازی و پس از تایید قطعات ژنی به ترتیب ctxb –gfp-stxb به یکدیگر ممزوج شدند. سپس، کاست ژنی ساخته شده، در وکتور بیانی pet28a(+) هم سانه ­ سازی شد. باکتری e . coli سویه ( de3 (bl21 ، توسط وکتور نوترکیب، ترانسفورم شد و بیان پروتئین، تحت القای iptg و الکتروفورز sds-page ارزیابی شد.   نتایج : ژن های تکثیر شده در وکتور pgem ، همسانه­سازی شدند و کلون­ها به کمک سه روش pcr ، هضم آنزیمی و توالی یابی، تایید شدند. قطعات ژنی تایید شده به ترتیب ctxb -gfp-stxb به یکدیگر ممزوج شد. پس از زیرهمسانه­سازی، وجود کاست ژنی ساخته شده به روش هضم آنزیمی تایید شد. برای این کاست ژنی، در e . coli سویه bl21(de3) ، بیانی مشاهده نشد.   نتیجه گیری : تعداد زیاد کدون های نادر در ژن های stxb و ctxb ، باعث عدم بیان کاست ژنی در e .coli شد. بنابراین، برای دستیابی به بیان و بهینه ­ سازی آن، یافتن میزبانی مناسب، ضروری است. با توجه به ساختار کاست ژنی و جایگاه آنزیم های محدودالاثر بر روی قطعه ساخته شده، ژن های مختلف را می توان جایگزین نموده و قطعات متنوع ژنی تولید نمود.